Microbiële matten zijn consortia van micro-organismen die een complex, verticaal gelaagd ecosysteem vormen. Deze benthische microbiële gemeenschappen zijn meestal te vinden in milieus die zich kenmerken door extreme condities. Kustgebieden die onder invloed van de getijden staan zijn een goed voorbeeld van een milieu waar microbiële matten zich ontwikkelen. Microbiële matten worden gedreven door fototrofe micro-organismen en worden gekenmerkt door de vrijwel gesloten biogeochemische cycli en geringe afmetingen (mm schaal). Daardoor zijn microbiële matten aantrekkelijke model ecosystemen. Daarnaast kunnen processen zoals microbiële evolutie, uitwisseling van genetische informatie en de wisselwerking tussen de verschillende soorten in een microbiële mat bestudeerd worden. Microbiële matten worden beschouwd als analoog aan de fossiele stromatolieten (gelaagde gesteentes gevorm door microbiële activiteit) die vanaf het begin van het Precambrium – zo’n 3,5 miljard jaar geleden – ontstonden en daarmee als de oudste bekende vorm van leven geldt. Microbiële matten in kustgebieden zijn van speciaal belang vanwege hun rol in de stabilisatie van het sediment en de vorming van kwelders en duinen. Deze vorm van natuurlijke kustbescherming is van belang gezien de klimaatverandering, mondiale temperatuurstijging en verwachte stijging van de zeespiegel.

Microbiële mat van cyanobacteriën op het strand van Schiermonnikoog (links) en een sectie van een microbiële mat met de verschillend gekleurde lagen met fototrofe microorganismen (rechts). Onder de laag van cyanobacteriën bevindt zich een laag van purperen zwavelbacteriën.

Een belangrijk onderzoeksterrein zijn de stranden aan de Noordzeekust van het Waddeneiland Schiermonnikoog. Hier hebben microbiële matten in dertig jaar tijd een breed wit zandstrand getransformeerd tot een groen, kweldergebied met een enorme rijkdom aan zoutminnende planten, verschillende vogelkolonies en vele soorten insecten. Dit was alleen mogelijk doordat micro-organismen en vooral cyanobacteriën in staat zijn om het zand vast te leggen en te verrijken met voedingsstoffen zoals koolstof- en stikstofrijke verbindingen. Ondanks intensieve fysiologische, ecologische en taxonomische studies is er nog maar weinig bekend over de genetische samenstelling van microbiële matten, de microbiële diversiteit en de netwerken van metabolisme en de interacties tussen de verschillende organismen. Daarom is in 2006 een begin gemaakt met een diepgaande moleculaire analyse van microbiële matten.

Microbiële diversiteit

Met behulp van moderne analyse technieken voor het bepalen van grote aantallen DNA sequenties van het gen voor een van de ribosomaal RNAs (16S rRNA) hebben we inzicht verkregen in de samenstelling van de microbiële gemeenschappen. Het gen coderend voor 16S rRNA wordt alom gebruikt voor de identificatie van micro-organismen. Door de DNA sequentie van dit gen van een specifiek organisme op te helderen en te vergelijken met een database met vele tienduizenden 16S rRNA sequenties kunnen we nagaan aan welk soort het onbekende gen het meest verwant is. Dit kan worden gedaan met geïsoleerde micro-organismen maar hele gemeenschappen. In dat laatste geval krijgen we een overzicht van alle 16S rRNA gen sequenties – en dus soorten micro-organismen – die in zo’n gemeenschap aanwezig zijn. Met de conventionele technieken kunnen er enkele tientallen tot honderden DNA sequenties vergeleken worden, maar met “next generation sequencing” (NGS) kunnen nu vele honderdduizenden sequenties vergeleken worden. Op deze manier hebben we bijna 250.000 korte (~60bp) sequenties verkregen van Bacteriën en Archaea uit 3 verschillende microbiële mat typen van Schiermonnikoog. Deze matten bleken zeer divers te zijn en mogelijk meer dan 2000 verschillende soorten Bacteriën en Archaea te bevatten. De soortensamenstelling was bovendien erg afhankelijk van de verschillende matten. De soortensamenstelling per mat was meer of minder constant gedurende de verschillende seizoenen.

De samenstelling van de Proteobacteria in microbiële matten van Schiermonnikoog tijdens verschillende seizoenen.

Het onderzoek wordt voortgezet met de analyse van de samenstelling van microbiële Eukarya in deze matten door het sequensen van het 18S rRNA gen. Doordat de techniek snel vordert zijn we nu in staat om stukken DNA van ~500bp via NGS te analyseren waardoor een betere identificatie van de soorten mogelijk wordt. Naast sequentie analyse kunnen we microbiële gemeenschappen ook vergelijken met behulp van zogenaamde moleculaire vingerafdrukken. Hierbij wordt ook gekeken naar diversiteit van de 16S en 18S rRNA genen maar dan door deze moleculen te scheiden op een denaturerende gel. Met behulp van denaturerend gradiënt gel elektroforese (DGGE), worden de genen gescheiden op grond van verschillen in het GC gehalte. Op deze wijze kunnen we snel en eenvoudig meerdere monsters (van verschillende plekken of tijdstippen) met elkaar vergelijken. Toepassing van deze techniek op de matten van Schiermonnikoog laat een klustering zien van de drie domeinen van leven (Bacteriën, Archaea en Eukarya) volgens de eerder geïdentificeerde typen matten. De microbiële samenstelling kwam ook overeen met de fotosynthetische pigmenten die laat zien dat diatomeeën overheersen in het zoute gedeelte (laagwaterlijn), cyanobacteriën in het brakke gedeelte (halverwege laagwaterlijn), en groenwieren in het zoete gedeelte van het strand (dicht bij de duinen).

De verdeling van micro-oganismen in een microbiële mat naar functionele groepen.

Metagenoom analyse

Het metagenoom van een microbieel ecosysteem is het totaal aan genetische informatie daarin aanwezig en vormt de som van de genomen van alle daarin aanwezige soorten micro-organismen. Door metagenoom analyse zijn we in staat het genetische potentieel van een microbiële mat op te helderen. Totaal DNA wordt van verschillende types microbiële mat geëxtraheerd en gezuiverd waarna de basenvolgorde van het totale DNA door middel van hoge capaciteit sequensen technieken bepaald wordt. Bioinformatica is nodig om de vele honderdduizenden DNA sequenties te analyseren, identificeren, assembleren en annoteren. Hierna kan het zogenaamde metagenoom onderzocht worden, grote stukken genetische informatie van de vele honderden soorten van micro-organismen in microbiële matten en gebruikt worden bij de analyse van het metatranscriptoom. Deze informatie zal inzicht verschaffen in bekende maar ook nog onbekende metabolisme routes en netwerken die een rol spelen in de microbiële mat. Verder verwachten we dat deze analyses zullen leiden tot de ontdekking van genen die coderen voor nieuwe bioactieve stoffen (bijvoorbeeld antibiotica of enzymen) met biotechnologische of farmaceutische toepassingen.

Cyanobacteriën zijn de belangrijkste primaire producenten in de microbiële matten en verzorgen de rest van de microbiële gemeenschap met substraat en geschikte leefomstandigheden. Dus zijn vele soorten bacteriën afhankelijk van de producten geproduceerd door de cyanobacteriën. Cyanobacteriën zijn de enige tot nu toe bekende prokaryoten met een biologische klok waarmee ze een dag/nacht ritme aan kunnen houden. Hierdoor kunnen ze efficiënt processen van elkaar scheiden die dan wel overdag (fotosynthese en CO₂ fixatie) of ‘s nachts (stikstoffixatie, fermentatie) plaats vinden. De interne moleculaire klok is een samenwerking tussen verschillende zogenaamde klok-eiwitten met als centraal eiwit KaiC. Dit eiwit zorgt voor de regulatie van de activiteit van een groot aantal andere eiwitten die dan wel overdag dan wel gedurende de nacht nodig zijn.

Dit inzicht leidde tot de volgende hypothese; de biologische klok van cyanobacteriën beïnvloedt niet alleen de eigen genregulatie maar via de dag- en nacht afhankelijke productie van substraten (suikers, zuren, stikstofhoudende verbindingen) controleert het de gehele metabolisme netwerk van de mat. Dit kan worden onderzocht door het meta-transcriptoom – het totaal aan messenger RNA dat codeert voor eiwitten – te bepalen en vervolgens te analyseren. Omdat dit vanwege de complexiteit van het systeem lastig is, wordt er eerst gekeken naar synthetische microbiële matten, waarbij geselecteerde soorten van mat-organismen waarvan het genoom bekend is (cyanobacteriën, heterotrofe bacteriën en sulfaat-reducerende bacteriën) onder laboratorium condities gekweekt worden en het transcriptoom vergeleken in reincultuur en in gedefinieerde mengcultures gedurende dag- en nacht cycli. Het geheel aan data wordt door middel bioinformatica in een microbieel systeem ecologische aanpak geanalyseerd en beschreven.

Het vermogen van bacteriën om zich snel aan te passen aan veranderende omgevingsfactoren is wel bekend. De evolutionaire en genetische mechanismen die ten grondslag liggen aan deze moleculaire adaptaties en de bronnen van genetische diversiteit zijn echter nog maar slecht begrepen. Mogelijke kandidaten voor zulke processen zijn het verkrijgen van externe genen via horizontale gentransfer en veranderingen in de primaire sequenties van eiwit coderende genen. Bovendien is her rangschikking van het genoom doormiddel van mobiele elementen ook vaak een bron van diversiteit binnen microbiële populaties. In tegenstelling tot de meeste bacteriële genen is de diversiteit van mobiele genen waarschijnlijk bepaald door de reproductieve interesses van de ‘selfish’ elementen. Om de relatieve bijdrage van deze mechanismen aan microbiële diversiteit te bepalen bestuderen we deze aspecten van de diversiteit aan de hand van de volledige sequenties van cyanobacteriële genomen.

Rangschikking van genen in het nitrogenase cluster van de cyanobacterie Microcoleus chthonoplastes en andere microorganismen. Hierbij wordt duidelijk dat Microcoleus dit cluster doormiddel van horizontale gen overdracht van δ-Proteobacteria of Chlorobi heeft gekregen. AV - Anabaena variabilis ATCC 29413; CY - Cyanothece PCC7424; CT - Chlorobium tepidum; SF  - Syntrophobacter fumaroxidans MPOB;  DV – Desulfovibrio vulgaris

Er worden op dit moment vier cyanobacteriële genomen door ons geanalyseerd: Lyngbya aestuarii, Microcoleus chthonoplastes, Nodularia spumigena en Cyanothece sp. Deze studies geven een omvattend overzicht van de dynamica van genen en regionen in deze cyanobacteriële genomen. Deze studies zullen ook inzicht geven in de adaptatie en evolutionaire processen op veronachtzaamde niveaus van microbiële diversiteit. Er zijn aanwijzingen voor moleculaire adaptatie in een aantal cyanobacteriële genen die betrokken zijn bij de fotosynthese, stikstoffixatie, gastheer verdediging en circadiaanse ritmes en genen van ‘selfish’ elementen. De toename van de genoomdata maakt het nu mogelijk om hypothesen te formuleren over de moleculaire adaptatie van grotere genoom regionen.

GC scan van de nitrogenase cluster van Microcoleus die laat zien dat er een diepe dip is links en rechts van het cluster die erop wijzen dat dit stuk door horizontale overdracht in het genoom van Microcoleus terecht is gekomen.

Fototroof picoplankton is de dominante primaire producent in aquatische ecosystemen. Deze groep organismen is heel divers en het is duidelijk geworden dat verschillende types co-existeren en aan specifieke niches zijn aangepast. Veel picoplankton is aangepast aan het gebruik van bepaalde nutriënten (bijvoorbeeld stikstof) of aan licht. Veel soorten hebben zich bovendien aangepast aan het efficiënte gebruik van een deel van het onderwater lichtspectrum door het produceren van specifieke pigmenten.

Kleurrijke diversiteit van fototroof picoplankton.

Wij bestuderen de genetische diversiteit van fototroof picoplankton in reinculturen, analyseren hun eigenschappen en proberen hun niche in de natuurlijke omgeving te identificeren. Daarbij maken wij gebruik van verschillende technieken zoals onder meer flow cytometrie en fluorescent in situ hybridisatie. Dit onderzoek breidt zich nu ook uit naar cyanobacteriën in microbiële matten.

Microscopische beeld van twee soorten picoplankton opgenomen met autofluorescentie. De rode soort fluoresceert oranje, de groene soort rood. De twee soorten verschillen in grootte en in groeisnelheid. Onder bepaalde omstandigheden komen beide soorten naast elkaar voor, waarbij ze het lichtspectrum onderling verdelen.

Het doel van dit onderzoek is de integratie van fotosynthese met het stroomafwaarts gebruik van de primaire producten van fotosynthese, om zodoende te kunnen begrijpen hoe lichtabsorptie leidt tot groei. De belangrijkste onderzoeksvraag is het lot van het gefixeerde koolstof en hoe de stroom naar de metabolieten poelen in verschillende organismen gereguleerd is. De benadering is een combinatie van ecologische, fysiologische, biofysische, biochemische en moleculair biologische methodes.

De centrale vraag is hoe de relatie tussen lichtabsorptie, PSII ladingscheiding (de primaire fotochemische reactie in PSII) en CO2 fixatie gereguleerd is. Fotosynthese is gedefinieerd as de conversie van licht in biochemische energie. Nadat de primaire fotochemische reactie heeft plaatsgevonden, genereert de fotosynthetische elektronentransportketen de ΔpH die nodig is voor ATP synthese en de NADH wordt stroomafwaarts bij PSI gevormd. Samen levert dit de energie en reductie equivalenten die nodig zijn in de Calvin-Benson-Bassham cyclus voor CO2 fixatie.

De elektronen die door fotosynthese worden gegenereerd kunnen echter ook alternatieve routes gaan. Deze routes zijn bijvoorbeeld de Mehler reactie/water-tot-water cyclus, PSII cyclische elektronentransport (een in wieren slecht begrepen proces waarbij cytb559 betrokken is), (bovenmatige) nitraat reductie, en een chloroplast terminale oxidase (PTOX) welke gelokaliseerd is aan de stroma zijde van de thylakoide membraan. PTOX is nauw gerelateerd aan de cyanide resistente alternatieve oxidase uit mitochondria en kan geremd worden door propyl gallate (PGAL) of SHAM. De functie van PTOX is onduidelijk, maar er is verondersteld dat het zou kunnen functioneren als een veiligheidsklep voor PSII. Andere onderzoeken wijzen op een functie als veiligheidsklep voor PSI.

Het fotobiologie onderzoek richt zich op hoe stressvolle condities de relatie tussen PSII elektronentransport en CO2 fixatie beïnvloeden en bestudeert processen die zijn gerelateerd aan dynamische (xanthofyl cyclus, PSII cyclische elektronentransport) en chronische (beschadiging van D1 eiwit, stimulatie van psbA expressie) neerregulatie van PSII. Het zou interessant zijn te zien of verschillende taxa van wieren die dezelfde niche bezetten, dezelfde algemene patronen van stressresponse vertonen. Dit is niet altijd het geval. De picocyanobacteriën Synechococcus en Prochlorococcus hebben twee verschillende strategieën. Synechoccoccus acclimatiseert aan hoge lichtintensiteit vooral door een hogere turnover van de hoge lichtintensiteit vorm van D1 (cyanobacteriën hebben twee vormen van D1), terwijl de resistentie voor hoge lichtintensiteit van Prochlorococcus vooral werd verkregen door een toename van de hoog licht induceerbare eiwitten (gecodeerd door de hli genen) en door PTOX (Berg et al. 2011).

Het fotobiologische onderzoek omvat de volgende projecten:

1. De relatie tussen PSII elektronentransport en C-fixatie in verschillende milieus.

De benodigde quanten voor koolstoffixatie varieert tussen de verschillende meetstations in het Oosterschelde estuarium. In het algemeen is 4 het theoretische minimum aantal quanten voor koolstoffixatie (Φe,C-1). Er is echter een variatie in dit getal van jaar tot jaar. In het kader van het EU-FP7 project PROTOOL werd een meta-analyse  van deze quantenvraag gedaan, op basis waarvan regionale algoritmes werden ontwikkeld die Φe,C kan voorspellen als een functie van milieufactoren zoals zoutgehalte, temperatuur en concentratie van voedingsstoffen.

De kwantum behoefte voor CO₂ fixatie gevolgd gedurende twee jaren en op verschillende meetstations in de Oosterschelde laten variaties zien die afwijken van de theoretische waarde 4.

2. Wat is de rol van alternatieve elektronenputten? 

Dit project onderzoekt hoe de Mehler reactie, PTOX of PSII cyclische elektronentransport de relatie tussen PSII en PSI activiteit beïnvloedt en hoe nutriëntbeperking alleen of in combinatie met hoge lichtintensiteit daar een rol bij speelt. Het belang van compenserende veranderingen in de activitiet van PSII (toenemende turnover tijd) staat centraal bij deze vraagstukken. Het begrijpen hoe dit proces in zijn werk gaat en hoe het varieert tussen verschillende soorten zouden voorspellingen mogelijk maken en geeft de mogelijkheid om automatische fluorimeters gebaseerd op de FRRF techniek te plaatsten op vele soorten platforms (veerboten, onderzoeksschepen, slimme boeien). Dit zou dan kunnen leiden tot een meer omvattende beeld van CO2 fixatie in de oceaan. Daarenboven kan dit gecombineerd worden met andere automatische optische metingen zoals hyperspectrale oppervlakte reflectie.

PTOX is actief in monsters genomen van de Atlantische Oceaan. Remming van PTOX door propyl gallaat (PGAL) resulteerde in een toename van F en Fm’ en een afname van de effectieve quanten efficiëntie. PTOX activiteit verzekert dus een efficiënte PSII elektronentransport.  Het is moeilijk om te bepalen of het effect veroorzaakt werd door de remming van de veiligheidsklep functie van PSII of dat het effect indirect was doordat PSI cyclische elektronentransport geremd was.

Eerdere resultaten lieten zien dat gedurende normale steady state fotosynthese de Mehler reactie een behoorlijk groot deel van de totale fotosynthetische elektronen stroom (tot 20-30%) en 50% van de totale light gestimuleerde zuurstof opname. De Mehler reactie activiteit spiegelt de fotosynthese snelheid.

Door licht geremde PSII reactie centra verlenen bescherming tegen licht door de verspilling van de teveel geabsorbeerde licht energie. De overige functionele PSII reactie centra kunnen eventueel hun activiteit doen toenemen en zodoende voor het verlies van actieve reactie centra compenseren. DCMU titratiecurves in laaglicht (LL) en onder hoge lichtintensiteit (HL) gekweekte cellen van de eencellige cyanobacterie Microcystis laten zien dat de maximum snelheid van de elektronen transport snelheid (ETR) meer wordt aangetast dan de CO2 fixatie. In de LL cellen kunnen tot 34% van de PSII reactiecentra worden geïnactiveerd totdat de maximum snelheid van de CO2 fixatie wordt aangetast. Voor de HL cellen is dit 25% van de PSII reactiecentra. Dit kan verklaard worden door de versnelde PSII re-oxidatie. LL cellen hebben een grotere PSII capaciteit dan HL cellen en dit kan worden toegeschreven aan het feit dat LL cellen meer pigment bezitten en daarom meer licht absorberen als ze een oppervlakte bloei vormen.

DCMU titratie curves in cellen van de cyanobacterie Microcystis gekweekt onder laag licht (LL) en hoog licht (HL). De maximum elektronen transport snelheid (ETR) is meer aangetast dat CO₂ fixatie. In de LL cellen moet tot 34% van de PSII reactie centra geïnactiveerd worden alvorens de maximum CO₂ fixatiesnelheid getroffen wordt. Voor HL cellen is dit 25%.

3. Hoe komen de dagelijkse patronen in de fotosynthese tot stand?

Experimenten met een gesynchroniseerde cultuur van diatomeeën (kiezelwier) laten zien dat de fotosynthetische activiteit gerelateerd is aan de celcyclus. De fotosynthetische activiteit was het laagst net voor de celdeling als de meeste cellen in de G2/M fase zijn. Dit onderzoek richt zich op het verder ophelderen van de rol van de celcyclus en op het beantwoorden van de vraag of moleculaire klokken betrokken zijn bij het reguleren van de fotosyntheseactiviteit. Een andere vraag is of deze processen ook het gedrag beïnvloeden zoals de verticale migratie van benthische diatomeeën of dat het eerder de biofysische fotoprotectie bepaalt.

De fotosynthetische activiteit van PSII in fytoplankton past zich aan gedurende het verloop van een dag. Tijdens het middaguur wordt ETRmax geactiveerd, hetgeen gepaard gaat met een verlaging van de licht-beperkte fotosynthetische efficiëntie (αETR). Het is niet bekend of dit patroon wordt bepaald door de dagelijkse lichtcyclus of dat de celcyclus of een moleculaire klok erbij betrokken is.

Microfytobenthos past zijn fotosynthetische activiteit gedurende de dag-nacht cyclus aan en reguleert het omlaag gedurende de nacht. Belangrijker is het feit dat de verticale migratie van benthische diatomeeën in het sediment onder controle is van een klok, omdat dit proces gedurende verschillende dagen in het donker doorgaat in de afwezigheid van milieu stimuli zoals dag-nacht en getijden cycli. De verticale migratie door microfytobenthos bepaalt dus voor een belangrijk deel de biochemie van de diatomeeën biofilm.

De parameters die een snelle licht curve (RLC) beschrijven. rETR_max is de maximum snelheid van PSII elektronen transport. Ieder meetpunt is het resultaat van een fit van RLC. Deze resultaten, verkregen met behulp van de FRRF techniek, laat een ongekende hoge tijdresolutie van fotosynthetische activiteit zien.

4. Fotoprotectie

Hoge licht intensiteiten veroorzaken schade in alle fototrofe organismen, tenzij deze over beschermende mechanismen beschikken.  Verschillende genen die betrokken zijn bij de fotosynthese kunnen een rol bij de fotoprotectie spelen. Daaronder zijn rbcL (Rubisco, grote ondereenheid), psbA (D1 eiwit), genen die coderen voor chlorofyl a en hli genen (High Light Inducible Proteins). Sommige HLIPs zijn betrokken bij de fotoprotectie maar andere kunnen een rol spelen bij verschillende soorten stress responses. Een analyse van de HLIPs van 3 estuariene cyanobacteriën liet zien dat de diversiteit van deze genen van een enkel organisme net zo groot is als tussen verschillende soorten en dat deze genen waarschijnlijk onderhevig zijn van horizontale gen transfer.

We bestuderen de activiteit van genen die betrokken zijn bij fotoprotectie en relateren dit aan de fysiologische response van de organismen ten gevolge van de blootstelling aan hoge lichtintensiteiten. We zoeken naar de functionele analoog van de psbS gen in wieren van de rode fylogenetische komaf (b.v. diatomeeën). Het product van de psbS in hogere planten speelt een sleutelrol bij de verspilling van overbodige energie door het binden van protonen en zeaxanthine en initieert zodoende een verandering in de structuur waardoor de snelheidsconstante van warmteverlies toeneemt. Dit onderzoek zal ook de rol van de hli genen en die van psbA bestuderen. Verder bestuderen wij de activiteit van genen betrokken bij fosfaatopname onder fosfaat-beperkende omstandigheden.

Fotosynthese is de omzetting van licht in biochemische energie. Deze energie wordt gebruikt voor de fixatie van CO₂ in organische stof. Dit proces wordt aangeduid als primaire productie en vormt de basis van het voedsel web. Ons onderzoek richt zich op het ophelderen van het lot van recent gefixeerde CO₂ in marine fototrofe micro-organismen. Fotosynthese, CO₂ fixatie, en het lot van de gefixeerde koolstof zijn nauw met elkaar verbonden. Wij proberen antwoorden te vinden op de volgende vragen:

1. Hoeveel van het nieuw gefixeerde koolstof gaat verloren door respiratie?

Wij onderzoeken hoe respiratie afhangt van milieuomstandigheden zoals de troebelheid van het water en de voedingstoffenconcentraties, en hoe dit varieert tussen verschillende taxa. Dit zal ons vervolgens toestaan om de elektronenbehoefte van netto koolstoffixatie te bepalen (d.w.z de elektronenbehoefte van groei).

2. Wat stuurt de uitscheiding en opslag van koolstof?

De gefixeerde koolstof kan of voor de synthese van structureel celmateriaal gebruikt worden of voor ander, niet-structurele verbindingen. Een deel van het gefixeerde koolstof kan worden uitgescheiden bijvoorbeeld als extracellulaire polymere substanties, of als glycollate, het resultaat van fotorespiratie, en een ander deel kan intracellulair worden opgeslagen. Dit kan het gevolg zijn van niet gebalanceerde koolstofmetabolisme wanneer er tekorten zijn van essentiële voedingsstoffen, zoals stikstof, maar kan ook het normale metabolisme van de cel dienen. Koolstof opslag is nodig voor het continueren van het cellulaire metabolisme (groei en/of onderhoud) gedurende de nacht wanneer fotosynthese niet plaats kan vinden, of kan dienen als een buffer voor elektronen (bijvoorbeeld in het geval van neutrale lipiden). Dit laatste heeft ook belangrijke implicaties voor toegepast onderzoek (bijvoorbeeld de productie van biodiesel door fototrofe micro-organismen). Dit onderzoek volgt twee types van experimentele benaderingen.

Het merken van een monster van een fotobioreactor met de mariene groenwier Tetraselmis met ¹³C bicarbonaat. Met behulp van HPLC-IRMS werd de snelheid gemeten waarmee het gemerkte koolstof in verschillende koolhydraten (gehydrolyseerd tot monomeren) terecht kwam. Glucose liet de hoogste snelheid zien, maar er werd ook een behoorlijke hoeveelheid in galactose aangetroffen. Dit is een celwand suiker en is daarom indicatief voor de groeisnelheid.

Ten eerste volgen we de snelheid van labelen van poelen van metabolieten door het stabiele isotoop van koolstof (¹³C) als een functie van milieuomstandigheden. Ten tweede zullen we expressiepatronen volgen van sleutelenzymen betrokken bij de opslagroutes onder verschillende en fluctuerende milieuomstandigheden en zullen meer te weten komen over de ‘lipide schakel’, de metabolische schakel die de opslag van lipiden bepaalt. Deze enzymen zijn o.a. ADP-glucose pyrofosforylase (zet glucose-1-fosfaat om in ADP-glucose, een sleutel enzym voor de opslag van glucose als een glucose polymeer, en genen die enzymen coderen die betrokken zijn bij de lipide synthese: C16:0: Acetyl-CoA carboxylase (ACCase) en FA synthase (FAS), die de verlenging tot C16:0 faciliteert, en desaturases, die onverzadigde vetzuren vormt.

3. Hoe werkt het koolstof concentratie mechanisme (CCM) onder fluctuerende pCO₂?

We bestuderen de rol van alternatieve elektronen putten bij lage pCO₂. Dit onderzoek is relevant voor oceaanverzuring maar ook voor het ontwerpen van fotobioreactoren met hun inherente hoge concentratie van biomassa en dus grote fluctuaties van pCO₂. Lage pCO₂ (lage DIC) en hoge pO₂ vormen een lastige combinatie voor microbiële wieren en voor cyanobacteriën omdat het de oxygenase reactie van Rubisco stimuleert (fotorespiratie)n daarom kan een lage DIC de fotosynthese beperken. Ons onderzoek richt zich op het ophelderen van de strategieën die microbiële wieren en cyanobacteriën hebben ontwikkeld om deze omstandigheden het hoofd te kunnen bieden. Dit onderzoek is van eminent belang voor toegepast onderzoek, vooral voor wat betreft het gebruik van microbiële wieren voor de productie van derde generatie biobrandstoffen.

Mariene sedimenten spelen een belangrijke rol bij de mineralisatie van organische stof. Het mineraliseren van organische stof wordt vooral gedaan door de zeer diverse microbiële gemeenschap. Het is echter gebleken dat het moeilijk is om deze processen aan de microbiële gemeenschapsstructuur te relateren, omdat veel van de aangetoonde micro-organismen geen vertegenwoordigers in laboratoriumcultuur hebben. Daarom blijft hun rol in biogeochemische processen en interacties met andere leden van de gemeenschap onbekend.

Een biofilm van kiezelwieren op een getijden slikplaat (links) en een scanning electron microscopische opname ervan (rechts).

Wij proberen dit gat in onze kennis van de structuur-functie relatie in microbiële gemeenschappen te dichten door het toepassen van technieken met stabiele isotopen, waarmee we processen kunnen volgen, te combineren met biologische markers zodat we de actieve, functionele groepen van micro-organismen kunnen identificeren. Een focus is de ontwikkeling van een protocol voor het invangen van rRNA doormiddel van magnetische bolletjes die specifieke fylogenetische groepen van sulfaatreducerende bacteriën kunnen onderscheiden. We bestuderen ook hoe functionele groepen van bacteriën zich verhouden tot algemene milieukenmerken zoals koolstof mineralisatie snelheden.

Wij bestuderen chemoautotrofe bacteriën vanwege hun belang voor de re-oxidatie van gereduceerde verbindingen zoals sulfide en ammonium die in anaerobe sedimenten worden geproduceerd. Re-oxidatie is een belangrijk proces in kustsedimenten en is verantwoordelijk voor 70% van de zuurstofflux. Wij bestuderen chemoautotrofie door het merken met ¹³C-bicarbonaat van sediment in het donker en volgen deze merker vervolgens in lipiden zoals PLFA en archaea etherlipiden. Hierdoor kunnen wij de snelheden en verdeling van chemoautotrofie bestuderen in relatie tot de redoxzones in het sediment. Evenzo kunnen wij ook de actieve microbiële groepen identificeren. We zijn verder van plan om de actieve chemoautotrofe bacteriën te identificeren door het bestuderen van de diversiteit van de functionele sleutelgenen die betrokken zijn bij de verschillende chemoautotrofe metabolische routes zoals die in bacteriën en archaea gevonden worden.

De microbiële stikstof cyclus bestaat uit een assimilatie en een dissimilatie deel. In het eerste worden stikstofverbindingen opgenomen door micro-organismen om te worden gebruikt voor de synthese van structurele cel componenten en dus voor groei. De stikstof komt weer vrij in het milieu na de dood en decompositie van het organisme. Bijna alle vormen van stikstof kunnen door micro-organismen worden opgenomen, met uitzondering van stikstof gas (N₂) dat 78% van onze atmosfeer uitmaakt. Lucht is de grootste bron van stikstof in de biosfeer. Alleen gespecialiseerde bacteriën en een enkele archaea kunnen met behulp van het enzym nitrogenase de sterke binding tussen de twee stikstofatomen breken en het N₂ assimileren. In de cel is stikstof in de gereduceerde vorm aanwezig. Uiteindelijk wordt ammoniak uit de organische stikstof vrijgemaakt en in het milieu afgegeven. De oxidatie van ammonium levert energie op (dissimilatie) dat gebruikt wordt voor de fixatie van CO₂ (chemosynthese). Aerobe chemosynthetische bacteriën kunnen ammonia oxideren tot nitriet (nitritificatie). In de zee lijken archaea (Thaumarchaeota) daarvoor verantwoordelijk. Andere chemosynthetische bacteriën oxideren nitriet tot nitraat (nitratificatie). Onder anaerobe condities kan ammonium met nitriet geoxideerd worden tot N₂ (ANAMMOX). Nitraat kan worden gerespireerd (anaerobe ademhaling) en gereduceerd tot nitriet, wat op zijn beurt gereduceerd kan worden tot ammonia. Denitrificatie is de reductie van nitriet tot N₂ (en andere gasvormige stikstofverbindingen).

Schema van de stikstofcyclus in een marien sediment.

In dit project onderzoeken we snelheden waarmee de verschillende stappen in de stikstofcyclus optreden en welke organismen daarbij betrokken zijn. We willen daarbij ook te weten komen of de stikstofcyclus in tijd en ruimte gescheiden optreedt in de Waddenzee en de aanpalende Noordzee. Daarbij worden stikstofverbindingen gebruikt die gemerkt zijn met het stabiele ¹⁵N isotoop. Met behulp van massaspectrometrie kunnen de omzettingen van deze verbindingen gevolgd worden. De diversiteit van functionele genen die coderen voor enzymen die bepaalde stappen in de stikstofcyclus katalyseren wordt bepaald doormiddel van kloonbibliotheken en met behulp van de microarray ‘Geochip’ en hun activiteit bepaald door de kwantitatieve analyse van de transcripten.

Nitrogenase, het enzym dat verantwoordelijk is voor de stikstoffixatie, is buitengewoon gevoelig voor zuurstof en de omzetting van N₂ naar ammonium vraagt bovendien een grote hoeveelheid energie. Cyanobacteriën zijn organismen met een fotosynthese apparaat dat lijkt op die van groene planten en dat ook zuurstof vormt. Veel cyanobacteriën kunnen N₂ fixeren maar  dat lijkt in contradictie met de zuurstofgevoeligheid van het proces. Deze cyanobacteriën hebben echter verscheidene aanpassingen ontwikkeld om aan de voorwaarden voor stikstoffixatie te voldoen. Stikstoffixerende cyanobacteriën kunnen in vier groepen worden ingedeeld, al naargelang de strategie die zij hebben ontwikkeld om de incompatibiliteit van stikstoffixatie en oxygene fotosynthese te omzeilen.

Stikstoffixerende cyanobacteriën. Linker kolom: heterocysten-vormende cyanobacteriën. Middelste kolom: niet-heterocysten-vormende draadvormige cyanobacteriën. Rechter kolom: eencellige cyanobacteriën.

Een grote groep cyanobacteriën heeft geen speciale adaptatie en kan alleen N₂ fixeren onder anaerobe omstandigheden.  De meest geavanceerde aanpassing is de cel differentiatie waarbij speciale stikstoffixerende cellen worden gevormd (heterocysten) die een speciale celwand hebben die de gasdiffusie beperkt en die alleen anoxygene fotosynthese kunnen bedrijven.

Heterocyst. De heterocyst heeft alleen de anoxygene fotosysteem I en heeft een dikke celwand die als een diffusie barrière dient voor lucht.

De meeste cyanobacteriën die geen heterocysten kunnen vormen fixeren N₂ gedurende de nacht wanneer geen fotosynthese mogelijk is. De draadvormige cyanobacterie Trichodesmium, die in de tropische oceaan grote bloeien kan vormen, fixeert stikstof overdag, terwijl het geen heterocysten vormt. Wij bestuderen stikstoffixerende cyanobacteriën in de pelagische open oceaan en in estuaria en kustzeeën evenals in microbiële matten.

Wij bestuderen de aanpassingen die stikstoffixerende cyanobacteriën hebben ontwikkeld en onderzoeken hoe deze door de omgevingsfactoren worden opgelegd. Dit gebeurd in veldonderzoek maar de sleutelorganismen worden ook geïsoleerd en hun eigenschappen in reincultuur in het laboratorium bestudeerd. We gebruiken een combinatie van metingen van stikstoffixatie doormiddel van de acetyleenreductie methode en stabiele isotoop technieken en moleculair genetische benaderingen bijvoorbeeld door het meten en kwantificeren van de expressie van functionele genen en door fluorescentie in situ hybridisatie.

De werkgroep Mariene Microbiologie onderhoudt een unieke collectie van (mariene) cyanobacteriën en microscopische wieren. De Cultuur Collectie Yerseke (CCY) omvat momenteel ~500 stammen: ~300 cyanobacteriën, ~150 diatomeeën, en ~50 eukaryote wieren, waarvan de meeste beschikbaar zijn als reinculturen. In dit project verbeteren we de methoden, media, en cultuurcondities voor de isolatie en kweek van fototrofe micro-organismen, identificeren de geïsoleerde stammen feno- en genotypisch en ontwikkelen we protocollen voor hun langdurige (cryo) bewaartechnieken.

Blik in een van de klimaatkamers van de Cultuur Collectie Yerseke (links) en de curator aan het werk (rechts).